Պոլիմերազի շղթայի ռեակցիայի (PCR) ռեակցիայի ցանկացած բաղադրիչի ճշգրտումները կարող են փոխել արդյունքի որակը, կամ բարելավելով կամ նվազեցնելով արտադրանքի եկամտաբերությունը եւ որակը կամ բարելավելով ռեակցիայի առանձնահատկությունը եւ զգայունությունը: Վերջնական արդյունքի վրա ազդող պարամետրերը կարող են լինել ֆիզիկական (այսինքն `ջերմաստիճանի, ցիկլի ժամանակի) կամ քիմիական (այսինքն, կաղապարի կոնցենտրացիան, օգտագործվող ֆերմենտի տեսակը): Հետեւյալները մի քանի առանցքային գործոններ են, որոնք ազդում են ՊՇՌ-ի հաջողությունների վրա:
01 Մաքուր լաբորատոր պայմաններ
Քանի որ ՊՇՌ- ն ի վիճակի է հայտնաբերել ԴՆԹ-ի մեկ մոլեկուլը, կարեւոր է պահպանել լաբորատորիայում փխրուն պայմանները: Միշտ հագեք թարմ ձեռնոցներ, օգտագործեք ստերիլ ապակյա պատրաստվածքներ, խողովակներ եւ խողովակաշարային խորհուրդներ եւ ստերիլ լուծումներ, եւ աշխատանքը սկսելուց առաջ մաքրեք աշխատանքային տարածքները:
Մշտապես ներառեք վերահսկողության ռեակցիաները, առանց դիզայնի ԴՆԹ-ի եւ առանց ֆերմենտի, ապահովելու համար, թե արդյոք արդյունքները ճշգրիտ նմուշի ուժեղացման արդյունք են:
Մարդկանց մեծամասնությունը համոզված է, որ իրենց լուծումներով լուծումներ չկան, որոնք չհամապատասխանեն խնդիրների լուծման հեշտացմանը եւ նշանակված pipettes- ները միայն միմյանց կողմ են միայն PCR- ի համար: DNase- ը եւ RNase- ի PCR խողովակները, աէրոզոլային դիմացկուն խողովակները եւ լույսի կողպեքով աշխատող գլխարկով աշխատում են նաեւ խնդիրները նվազեցնելու ուղիներ:
02 Քիմիական բաղադրիչներ
- 18-ից 24 հիմքեր
- Չկան երկրորդական կառուցվածք (այսինքն, շտրիխ կոճակ)
- G / C եւ A / T զույգերի հավասարակշռված բաշխում
- 3-ոտքի եզրերին չեն լրացնում միմյանց
- Հալման ջերմաստիճան (Tm) մոտ 5-10 աստիճան ցածր ջերմաստիճանի ցածր ջերմաստիճանի ցածր ջերմաստիճանն է, որը սովորաբար կազմում է 55-65 աստիճանի Celcius
The Tm- ը, ինչպես երկուսն էլ, պետք է նման լինեն լավագույն արդյունքների համար:
03 Reaction Mix: Կաղապար եւ նախաներկեր
Օպտիմալ պրետրերային կոնցենտրացիաները 0.1-ից 0.6 մկլոմոլի / L- ի միջեւ են: Կաղապարի չափը տատանվում է կախված ԴՆԹ-ի տեսակից (մարդկային, բակտերիալ, պլազմիդ):
Շատ քիչ քանակությամբ կաղապարի հետ կապված, կան արդյունքներ բարելավելու այլ ռազմավարություններ, ինչպիսիք են աճող ցիկլի թվերը կամ «տաք սկիզբը»: Միշտ փորձեք նոր պրիմիերները դրական հսկողության ռեակցիայի հետ, համոզված լինելով, որ դրանք աշխատում են ձեր փորձարարական պայմաններում:
04 Reaction Mix: Ֆերմենտային գործունեություն
MgCl2- ի կոնցենտրացիան ռեակցիաների խառնուրդում կարող է ազդել ՊՇՌ արդյունքների վրա եւ կարող է ավելի կարեւոր դեր խաղալ ավելի շուտ ռեակցիաներում: Մագնեզիումի կատալիզը ձեւավորում է dNTP- ներով լուծվող բարդույթներ `արտադրելու իրական պաստառը, որը պոլիմերազի ֆերմենտը ճանաչում է:
Բոլոր չորս DNTP- ների հավասար քանակները նույնպես օգնում են նվազեցնել պոլիմերազի սխալը: Որոշ հավելանյութեր, ինչպիսիք են բետին, BSA, լվացող միջոցներ, DMSO, գլիցերինը եւ պիրոֆոսֆատազը կարող են նաեւ ազդել ֆերմենտի առանձնահատկությունների կամ ռեակցիայի արդյունավետության վրա:
05 Թերմոսիկի տեսակը
Լաբորատոր սարքավորումների գնումների ժամանակ հաշվի առեք, որ որոշ ջերմոցիկլներ պակաս ճշգրիտ են, քան մյուսները, պահպանելով ճշգրիտ, ցանկալի ջերմաստիճանը:
Սա մի վայր է, որտեղ գնում էժան չի վճարում երկարաժամկետ հեռանկարում, երբ դուք կանգնած եք բորբոքված արձագանքով կամ օգտագործելով այրիչներ, որոնք պահանջում են շնչառական ջերմաստիճանի նեղ շրջանակ:
Thin-walled ռեակցիայի խողովակները, որոնք նախատեսված են տեղադրելու հերմետիկացնող հստակ բրենդը, նաեւ օգնում են օպտիմալացնել ռեակցիաների ջերմաստիճանը:
06 ցիկլի պարամետրեր
Ավելի մեծ եկամտաբերություն կարելի է ձեռք բերել `յուրաքանչյուր 20 շրջանում երկարաձգման ժամանակի ավելացման միջոցով փոխհատուցելու համար ավելի քիչ ֆերմենտ, ավելացնելու համար ավելի շատ շաբլոն: Սովորաբար, 40-ից պակաս ցիկլը բավարար է 10-ից պակաս շաբլոն մոլեկուլների ավելացման համար, որոնք բավարար չափով խտացված են, դիտելու համար, թե ինչպես կարելի է դիտել bromide- ի կիտրոնաթթվի գդալը: