Սպիտակուցի մաքրության աստիճանը կախված է սպիտակուցի նպատակային օգտագործման աստիճանից:
Որոշ ծրագրերի համար հումքի քաղվածք բավական է: Այնուամենայնիվ, այլ օգտագործման համար, ինչպիսիք են սննդամթերքի եւ դեղերի, անհրաժեշտ է բարձր մակարդակի մաքրություն: Այսինքն, մի քանի սպիտակուցի մաքրման մեթոդները սովորաբար օգտագործվում են մի շարք մաքրման փուլերում:
Յուրաքանչյուր սպիտակուցի մաքրման քայլը սովորաբար հանգեցնում է որոշակի արտադրանքի կորստի: Հետեւաբար, իդեալական սպիտակուցների մաքրման ռազմավարությունը այն է, որտեղ մաքրման ամենաբարձր մակարդակը հասնում է ամենափոքր քայլերին: Ընտրության կիրառման ընտրությունը կախված է թիրախային սպիտակուցի չափից, գանձումից, լուծույթից եւ այլ հատկություններից: Հետեւյալ մեթոդները առավելագույնս համապատասխանում են մեկ ցիտոսոլային սպիտակուցի մաքրման համար: Ցիտոսոլիկ սպիտակուցային բարդությունների մաքրումը ավելի բարդ է եւ սովորաբար պահանջում է կիրառել տարբեր մեթոդներ:
Սպիտակուցի մաքրման առաջին քայլերը
Առաջին քայլը, ներծծող (ներսում բջիջների) սպիտակուցների մաքրման համար, նախապատրաստում է հումքի քաղվածք :
Քաղվածքը պարունակում է բջիջների ցիտոպլազմայի բոլոր սպիտակուցների բարդ խառնուրդ, ինչպես նաեւ որոշ լրացուցիչ մակրոմոլեկուլներ, կոֆակտորներ եւ սնուցիչներ: Քաղցր հյութը կարող է օգտագործվել կենսատեխնոլոգիայի որոշ ծրագրերի համար, սակայն, եթե մաքրությունը խնդիր է, ապա պետք է հետեւել հետագա մաքրման քայլերին:
Քաղցր սպիտակուցի քաղվածքները պատրաստվում են բջջային բեկորների հեռացումով, որոնք առաջանում են բջջային լիզինգի միջոցով, որը ձեռք է բերվում քիմիական նյութեր եւ ֆերմենտներ , sonication կամ ֆրանսիական մամուլ: Աղբը հանվում է ցենտրիֆուգացման միջոցով, եւ վերին շնչողը վերականգնում է: Արտազատվող սպիտակուցների հումքային պատրաստուկները կարող են ձեռք բերել պարզ բջիջները ցենտրիֆուգացման միջոցով:
Որոշակի կենսատեխնոլոգիայի կիրառման համար պահանջվում է ջերմաստիճանի ֆերմենտների պահանջ: Enzymes, որոնք կարող են հանդուրժել բարձր ջերմաստիճանները առանց denaturing եւ պահպանելով բարձր կոնկրետ գործունեություն: Նրանց արտադրող օրգանիզմները երբեմն անվանում են ծայրահեղություններ: Ջերմակայուն սպիտակուցը մաքրելու հեշտ մոտեցումն այն է, որ խառնուրդի մյուս սպիտակուցները ջեռուցման միջոցով ջերմացնեն, այնուհետեւ սառեցրեք լուծումը (այսպիսով թույլ տալով, որ ջերմաստիճանի ֆերմենտը բարեփոխի կամ վերաարտադրվի, անհրաժեշտության դեպքում, ատլատատիտացված սպիտակուցները կարող են հեռացվել ցենտրիֆուգացման միջոցով:
Միջանկյալ մաքրման քայլեր
Նախկինում հումքի քաղվածքից սպիտակուցը մաքրելու ընդհանուր երկրորդ քայլն այն էր, որ բարձր ջերմաստիճանի բարձրացում (այսինքն, աղ լուծումներ) լուծում: Նավթային թթուները հումքի քաղվածքում կարող են հեռացվել streptomycin sulfate կամ protamine sulfate- ով կազմված ագրեգատների կողմից:
Սպիտակուցների տեղադրումը սովորաբար արվում է ամոնիումի սուլֆատի միջոցով `որպես աղ:
Տարբեր սպիտակուցները կբարձրանան ամոնիումի սուլֆատի տարբեր կոնցենտրացիաներում: Ընդհանուր առմամբ, բարձր մոլեկուլային քսուքի սպիտակուցները ցրվում են ամոնիումի սուլֆատի ցածր կոնցենտրացիաներում: Աղի տեղադրումը սովորաբար չի բերում բարձր մաքրված սպիտակուցի, բայց կարող է նպաստել խառնուրդում որոշ անցանկալի սպիտակուցներ վերացնելու եւ նմուշի կենտրոնացումը: Այնուհետեւ լուծման մեջ աղերը դիալիզի միջոցով հանվում են ծակոտկեն ճարպաթթուների միջոցով, ֆիլտրում կամ գել արտահոսքի քրոմատագրմամբ:
Ժամանակակից կենսաթոշակային արձանագրությունները հաճախ օգտվում են բազմաթիվ առեւտրային մատչելի փաթեթներից, որոնք ապահովում են պատրաստի լուծումներ ստանդարտ ընթացակարգերի համար: Սպիտակուցի մաքրումը հաճախ կատարվում է ֆիլտրերի միջոցով եւ պատրաստված գել ֆիլտրացման սյունակներում: Բոլորը պետք է հետեւեք հրահանգներին եւ ճիշտ լուծումների ճիշտ ծավալը ավելացնեք եւ սպասեք նշված ժամանակի երկարությունը, որը հավաքում է սողունը (ինչն է սյունակի մյուս եզրը), թարմ փորձարկման խցիկում:
- Քրոմատոգրաֆիկ մեթոդները կարելի է կիրառել նստարանային սյուներ կամ ավտոմատացված HPLC սարքավորումներով: HPLC- ի բաժանումը կարող է իրականացվել հակադարձ փուլային, ion փոխանակման կամ չափերի բացառման մեթոդներով եւ դիոդային զանգվածի կամ լազերային տեխնոլոգիայի կողմից հայտնաբերված նմուշների միջոցով: مور
Սպիտակուցների արտացոլման եւ մաքրման գնահատում
- Հակադարձ փուլային քրոմատագրությունը (RPC) առանձնացնում է սպիտակուցները, հիմնված նրանց հարաբերական հիդրոֆոբիկայով : Այս տեխնիկան բարձր ընտրովի է, սակայն պահանջում է օրգանական լուծիչների օգտագործումը: Որոշ սպիտակուցներ մշտապես denatured լուծիչներ են եւ կկորցնեն գործունակությունը RPC- ում: Հետեւաբար այս մեթոդը չի առաջարկվում բոլոր դիմումների համար, հատկապես, եթե անհրաժեշտ է թիրախային սպիտակուցը պահպանել ակտիվությունը:
- Իոնների փոխանակման քրոմատագրությունը վերաբերում է սպիտակուցների բաժանարարությանը, որը հիմնված է մեղադրանքի վրա : Սյունակները կարող են կամ պատրաստ լինել ասոն փոխանակման կամ կատիոնի փոխանակման համար: Անիոնների փոխանակման սյունները պարունակում են կայուն փուլ `դրական մեղադրանքով, որը գրավում է բացասական լիցքավորված սպիտակուցներ: Կաթի փոխանակման սյունակները հակառակ, բացասական լիցքավորված բշտիկներն են, որոնք դրական լիցքավորված սպիտակուցներ են ներգրավում: Թիրախային սպիտակուցի (ները) վերացումը կատարվում է սյունակում pH փոխելու միջոցով, ինչը հանգեցնում է յուրաքանչյուր սպիտակուցի լիցքավորված ֆունկցիոնալ խմբերի փոփոխության կամ չեզոքացման:
- Չափերի բացառման քրոմատագրումը ( գել ֆիլտրացիան ) առանձնացնում է ավելի մեծ սպիտակուցներ փոքրերից, քանի որ խոշոր մոլեկուլները ավելի արագ են անցնում խաչաձեւ կապված պոլիմերի միջոցով, քրոմատագրության սյունակում: Խոշոր սպիտակուցները չեն համապատասխանում պոլիմերի ծակոտիներին, մինչդեռ ավելի փոքր սպիտակուցներն անում են եւ ավելի երկար են անցնում քրոմատագրման սյունակով, ավելի քիչ ուղղակի երթուղով: Eluate- ն հավաքվում է մի շարք խողովակների մեջ, որոնք առանձնացնում են սպիտակուցները `հիմնված էլյացման ժամանակ: Գել ֆիլտրացիան օգտակար գործիք է սպիտակուցի նմուշը կենտրոնացնելու համար, քանի որ թիրախային սպիտակուցը հավաքվում է ավելի փոքր տարրերի մեջ, քան նախապես ավելացվել է սյունը: Նման աղտոտման մեթոդները կարող են օգտագործվել մեծածավալ սպիտակուցների արտադրության ժամանակ, դրանց ծախսարդյունավետության պատճառով:
- Համակենտրոնացման քրոմատագրումը շատ օգտակար մեթոդ է սպիտակուցների մաքրման գործընթացը «փայլելու» համար կամ ավարտելը: Հղիների քրոմատագրման սյուներից բրոշյուրները խաչաձեւ կապված են լիգանդների հետ, որոնք կապում են հատկապես թիրախային սպիտակուցին: Այնուհետեւ սպիտակուցը հանվում է սյունից `լվանալով ազատ լիգանդ պարունակող լուծույթով: Այս մեթոդը տալիս է առավելագույն արդյունքներ եւ առավելագույն կոնկրետ գործունեություն `համեմատած այլ տեխնիկայի հետ:
- SDS-PAGE- ը պոլիարխիլամիդային գել էլեկտրոֆորեզ է, որը կատարվում է SDS- ի (նատրիումի dodecyl sulfate) ներկայությամբ, որը կապում է սպիտակուցների հետ, նրանց տալով մեծ ցանցային բացասական լիցք: Քանի որ բոլոր սպիտակուցների մեղադրանքները բավականին հավասար են, այս մեթոդը դրանք գրեթե ամբողջությամբ բաժանում է չափի վրա: SDS-PAGE- ը հաճախ օգտագործվում է սպիտակուցի մաքրությունը փորձարկելու յուրաքանչյուր քայլից հետո: Քանի որ անցանկալի սպիտակուցները աստիճանաբար հեռացվում են խառնուրդից, SDS-PAGE գելում պատկերված շղթաների քանակը կրճատվում է, քանի դեռ ցանկալի սպիտակուցը ներկայացնում է միայն մեկ խումբ:
- Իմունոբլոտինգը սպիտակուցների արտացոլման տեխնիկան է, որն օգտագործվում է համակենտրոնացման քրոմատագրման հետ: Հատուկ սպիտակուցի հակամարմինները օգտագործվում են որպես ligands որպես affinity քրոմատագրման սյունակում: Թիրախային սպիտակուցը պահպանվում է սյունակում, այնուհետեւ վերացվում է սյունը աղի լուծույթով կամ այլ նյութերով լվանալու միջոցով: Ռադիոակտիվ կամ գունային պիտակների հետ կապված հակամարմինները նպաստում են թիրախային սպիտակուցի հայտնաբերմանը, երբ այն բաժանվում է մնացած խառնուրդից:
Աղբյուրները.
Zubay G. 1988. Կենսաքիմիա, 2-րդ հրատարակություն: Macmillan Publishing Co., Նյու Յորք, NY, ԱՄՆ:
Amersham Pharmacia Biotech- ը: 1999 թ. Սպիտակուցի մաքրման ձեռնարկ, հրատարակություն AB: Ամերսհեմ Ֆարմա Բիոտեխ Սթ. Նյու Ջերսի, ԱՄՆ: http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.