Ինչ PCR- ն պետք է կատարի ԴՆԹ-ի կարգավորումը եւ ուժեղացնելով գեները
Պոլիմերազի շղթայական ռեակցիան ( ՊՇՌ ) գենային բազմացման մեթոդ է, որը գենի բազմակի օրինակ է եւ հանդիսանում է նաեւ գեն sequencing գործընթացի մի մասը:
Ինչպես է պոլիմերազի շղթայի ռեակցիան
Gene- ի պատճենները կատարվում են ԴՆԹ-ի նմուշով, եւ տեխնոլոգիան բավականաչափ լավ է, օրինակ, բազմակի օրինակները նմուշում հայտնաբերված գենի մեկ օրինակից: PCR- ի միաձուլումը միլիոնավոր օրինակներ պատրաստելու համար թույլ է տալիս հայտնաբերել եւ հայտնաբերել գենային հաջորդականությունների բացահայտումը, օգտագործելով տեսողական տեխնիկան, որը հիմնված է ԴՆԹ-ի կտորների չափից եւ գանձումից (+ կամ -):
Վերահսկվող պայմաններում ԴՆԹ-ի փոքր հատվածները գեներացվում են ԴՆԹ-ի պոլիմերազներով հայտնի ֆերմենտներով, որոնք ավելացնում են կոմպլեմենտար դեզոկինուկեոտիդները (dNTPs) որպես «ձեւանմուշ» որպես ԴՆԹ-ի մի կտոր: Պոլիմերազի համար մեկնարկային կետ է օգտագործվում նույնիսկ փոքր հատվածների ԴՆԹ-ն, որը կոչվում է «պրիմերներ»: Նախաներկերը փոքրիկ տեխնածին DNA (oligomers) կտորներ են, սովորաբար 15-30 նուկլեոտիդների միջեւ: Դրանք պատրաստվում են իմանալով կամ գուշակելով կարճ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, որն ուժեղացնում է գենի հենց ծայրերում: PCR- ի ընթացքում ԴՆԹ-ն հաջորդականությամբ ջերմացվում է, եւ կրկնակի տողերը առանձնանում են: Սառեցման արդյունքում լարերը կապում են կաղապարին (կոչվում են աղտոտում) եւ ստեղծում տեղը պոլիմերազի համար:
PCR տեխնիկան
Պոլիմերազի շղթայական ռեակցիան (ՊՇՌ) հնարավոր է դարձել ջերմոֆիլների եւ տերմոֆիլիկ պոլիմերազի ֆերմենտների հայտնաբերման շնորհիվ (բարձր պարունակությամբ ջեռուցումից հետո կառուցվածքային ամբողջականությունը եւ ֆունկցիոնալությունը պահպանող ֆերմենտները):
ՓՀՕ տեխնիկայի մեջ ներառված քայլերը հետեւյալն են.
- Խառնուրդը ստեղծվում է `օպտիմիզացված ԴՆԹ-ի կաղապարի, պոլիմերազի ֆերմենտի, լազերների եւ dNTP- ների օգնությամբ: Խառնուրդը ջերմացնելու ունակությունը առանց ֆերմենտի դիատրեցնելու համար թույլ է տալիս ԴՆԹ նմուշի կրկնակի ուղղաթիռը դիֆերենցել 94 աստիճան ջերմաստիճանի ջերմաստիճանում:
- Դիակաթորությունից հետո նմուշը սառեցվում է ավելի թույլ միջակայքում, շուրջ 54 աստիճանի, ինչը հեշտացնում է primers- ի անջատումը (պարտադիր) միայնակ ծածկված ԴՆԹ-ի կաղապարները:
- Ցիկլերի երրորդ փուլում նմուշը վերածվում է 72 աստիճանի, Taq DNA Polymerase- ի իդեալական ջերմաստիճանի երկարացման համար: Երկրագունության ժամանակ ԴՆԹ-ի պոլիմերազը օգտագործում է ԴՆԹ-ի բնօրինակը, որպես շերտ, յուրաքանչյուր լրացուցիչի 3-ի վերջերին լրացուցիչ dNTP- ների ավելացման եւ հետաքրքրության գենի շրջանում կրկնակի շերտավորված ԴՆԹ-ի հատվածի ավելացման համար:
- ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների վրա հիմնված նախշերները, որոնք չեն համապատասխանում ճշգրիտ համադրությանը, չեն շեղվում 72 աստիճանով, այդպիսով սահմանափակելով երկարատեւության գենը:
Denaturing, parenching եւ երկարաձգման այս գործընթացը կրկնվում է (30-40) անգամ, դրանով իսկ ավելացվում է խառնուրդի մեջ ցանկալի գենի պատճենների թիվը: Թեեւ այս գործընթացը բավականին ձանձրալի կլինի, եթե կատարվի ձեռքով, նմուշները կարող են պատրաստվել եւ ներկել ծրագրավորվող Thermocycler- ում, այժմ սովորական շատ մոլեկուլային լաբորատորիաներում, եւ 3-4 ժամվա ընթացքում կարող է կատարվել PCR ամբողջական ռեակցիա:
Յուրաքանչյուր denaturing քայլը դադարեցնում է նախորդ ցիկլի երկարացման գործընթացը, դրանով իսկ կրճատելով ԴՆԹ-ի նոր շերտը եւ պահելով այն ցանկալի գենի չափը:
Ազատացման ցիկլի տեւողությունը կարող է երկար կամ ավելի կարճ լինել, կախված տոկոսային գենի չափից, բայց ի վերջո, PCR- ի կրկնվող ցիկլերի միջոցով, կաղապարների մեծ մասը կսահմանափակվի միայն հետաքրքրության գենի չափով, քանի որ կթողարկվեն երկու պրեմիերաների արտադրանքից:
Արդյունավետ PCR- ի համար կան մի քանի տարբեր գործոններ, որոնք կարող են շահարկվել արդյունքների բարձրացման համար: PCR արտադրանքի առկայության համար փորձարկվող ամենատարածված մեթոդը ` agarose gel electrophoresis : ԴՆԹ-ի բեկորները բաժանվում են չափի եւ լիցքի վրա: Այնուհետեւ դրվագները արտացոլվում են ներկերի կամ ռադիոիզոտոպների միջոցով:
Էվոլյուցիան
Քանի որ PCR- ի հայտնաբերումը, հայտնաբերվել է ԴՆԹ-ի պոլիմերազներից, բացի Թագից: Նրանցից ոմանք ավելի լավն են «proofreading» ունակությունը կամ ավելի կայուն են ավելի բարձր ջերմաստիճաններում, այդպիսով բարելավելով ՊՇՌ-ի առանձնահատկությունը եւ սխալները dNTP- ի տեղադրումը նվազեցնելու համար:
PCR- ի որոշ տատանումները մշակվել են կոնկրետ ծրագրերի համար եւ այժմ պարբերաբար օգտագործվում են մոլեկուլային գենետիկական լաբորատորիաներում: Նրանցից ոմանք իրական ժամանակի PCR եւ Reverse-Transcriptase PCR են: PCR- ի հայտնաբերումը հանգեցնում է ԴՆԹ-ի հաջորդականացման, ԴՆԹ մատնահետքի եւ այլ մոլեկուլային մեթոդների զարգացման: